Kapitel 4: Der richtige Bauplan
Screening nach Phytase-kodierenden Genen
Nun beginnt die Suche nach deinem Wunschenzym. Um viel Enzym für den Prozess zu produzieren, brauchst du den "Bauplan" für dein Enzym: das Gen.
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Dafür muss die DNA der Mikroorganismen isoliert werden und dann wird geschaut, auf welchem kleinen Abschnitt der sehr großen DNA der Bauplan hinterlegt ist. Hierfür gibt es zwei unterschiedliche Ansätze: Das sequenzbasierte und das aktivitätsbasierte Screening.
Sequenzbasiertes Screening
Da die Sequenzierung von DNA immer schneller und günstiger wird, werden mittlerweile ganze Genome (die gesamte Erbinformation eines Organismus) oder Metagenome (die gesamte Erbinformation von Organismen einer Umweltprobe oder nach einer Anreicherung) sequenziert. Das heißt der gesamte genetische Code wird entschlüsselt. Durch Computerprogramme wird dieser Code anschließend ausgewertet. So können Gengrenzen in der DNA-Sequenz und die Funktion der daraus resultierenden Proteine vorhergesagt werden. Mit einer Gensequenz, die für eine bereits bekannte Phytase kodiert, können anschließend ähnliche Sequenzen in den unbekannten Sequenzierungsdaten der Umweltprobe oder Anreicherung gesucht werden.
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Aktivitätsbasiertes Screening
Du kannst auch direkt in der isolierten DNA einer Umweltprobe oder Anreicherung nach Abschnitten suchen, die für eine Phytase kodieren. Um in der großen Menge an DNA mit sehr vielen unterschiedlichen Informationen das gewünschte Gen zu finden, wird eine sogenannte Genbank erstellt. Hierfür wird die DNA zunächst in Fragmente zerkleinert. Die DNA-Fragmente werden anschließend in ringförmige DNA-Moleküle, sogenannte Plasmide, eingebracht. Diesen Vorgang nennen wir Ligation. Jedes der erzeugten Plasmide enthält im Optimalfall ein anderes Stück DNA. Um die auf den DNA-Fragmenten enthaltenen Informationen in Proteine umzuwandeln, werden die fertigen Plasmide in speziell dafür entwickelte Bakterien eingebracht. Diesen Schritt nennen wir Transformation. Die Bakterien werden anschließend auf festem Nährmedium verteilt und kultiviert. Dabei teilen sich die Bakterien, sodass kleine Zellhaufen entstehen, die wir Kolonien nennen. Jede Kolonie enthält idealerweise ein Plasmid mit einem anderen DNA-Fragment. Deine Genbank ist fertig!
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Jetzt wird es spannend: Nun kommen wir zum eigentlichen Screening. Wir müssen nun die Kolonie ausfindig machen, die unser gewünschtes Enzym produziert. Diese Bakterien enthalten auf dem Plasmid auch den Bauplan des Enzyms, also das Gen. Für den Nachweis von Enzymaktivitäten auf Kulturplatten gibt es verschiedene Methoden. Um Phytasen in einer Metagenombank nachzuweisen, wird den Kulturplatten Calcium-Phytat zugefügt. Ca-Phytat ist ein wasserunlösliches Salz was die Kulturplatten milchig-weiß färbt. Phytasen können das Ca-Phytat in wasserlösliche Produkte spalten. Dadurch werden die milchig-weißen Kulturplatten an Stellen mit Phytase-Aktivität klar und durchsichtig. Bakterienkolonien, die eine Phytase produzieren, weisen daher einen durchsichtigen Bereich um die Kolonie auf. Diesen Bereich nennen wir Halo.
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