Da die Sequenzierung von DNA immer schneller und günstiger wird, werden mittlerweile ganze Genome (die gesamte Erbinformation eines Organismus) oder Metagenome (die gesamte Erbinformation von Organismen einer Umweltprobe oder nach einer Anreicherung) sequenziert. Das heißt der gesamte genetische Code wird entschlüsselt. Durch Computerprogramme wird dieser Code anschließend ausgewertet. So können Gengrenzen in der DNA-Sequenz und die Funktion der daraus resultierenden Proteine vorhergesagt werden. Mit einer Gensequenz, die für eine bereits bekannte Cellulase kodiert, können anschließend ähnliche Sequenzen in den unbekannten Sequenzierungsdaten der Umweltprobe oder Anreicherung gesucht werden.

 

Man kann auch direkt in der isolierten DNA einer Umweltprobe oder Anreicherung nach Abschnitten suchen, die für eine Cellulase kodieren. Um in der großen Menge an DNA mit sehr vielen unterschiedlichen Informationen das gewünschte Gen zu finden, wird eine sogenannte Genbank erstellt. Hierfür wird die DNA zunächst in Fragmente zerkleinert. Die DNA-Fragmente werden anschließend in ringförmige DNA-Moleküle, sogenannte Plasmide, eingebracht. Diesen Vorgang nennen wir Ligation. Jedes der erzeugten Plasmide enthält im Optimalfall ein anderes Stück DNA. Um die auf den DNA-Fragmenten enthaltenen Informationen in Proteine umzuwandeln, werden die fertigen Plasmide in speziell dafür entwickelte Bakterien eingebracht. Diesen Schritt nennen wir Transformation. Die Bakterien werden anschließend auf festem Nährmedium verteilt und kultiviert. Dabei teilen sich die Bakterien, sodass kleine Zellhaufen entstehen, die wir Kolonien nennen. Jede Kolonie enthält idealerweise ein Plasmid mit einem anderen DNA-Fragment. Unsere Genbank ist fertig!

 

 

Jetzt wird es spannend: Nun kommen wir zum eigentlichen aktivitätsbasierten Screening. Wir müssen nun die Kolonie ausfindig machen, die unser gewünschtes Enzym produziert. Diese Bakterien enthalten auf dem Plasmid auch den Bauplan des Enzyms, also das Gen. Für den Nachweis von Enzymaktivitäten auf Kulturplatten gibt es verschiedene Methoden. Zum Nachweis von Polysaccharid-abbauenden Enzymen, wie Cellulasen, werden zum Beispiel AZCL-Substrate verwendet (AZCL = azurine-cross-linked = Azurin-gekoppelt). Bei der AZCL-Cellulose ist das wasserunlösliche Polysaccharid mit dem blauen Farbstoff Azurin chemisch verbunden. AZCL-Polysaccharide bestehen daher aus kleinen wasserunlöslichen blauen Krümelchen. An Stellen mit enzymatischer Aktivität wird das Polysaccharid in wasserlösliche Produkte gespalten, die in der Kulturplatte diffundieren können. Dadurch bildet sich eine blaue „Wolke“ um den Krümel. Diese Wolke nennen wir Halo.

 

Wenn du tiefer in das aktivitätsbasierte Screening einsteigen möchtest, schau doch mal in unser Wiki!